www.prostuda-gripp.ru

Целые «зверинцы» и питомники подопытных животных (виварии) стали теперь неотъемлемой частью вирусологических лабораторий. Вирусологам нужны животные определенного стандартного качества, выкормленные и содержавшиеся согласно установленным нормам как живые подопытные единицы, обладающие стабильной восприимчивостью к определенным болезнетворным вирусам. Требования к методам ухода и содержания особенно возрастают при проведении долгосрочных опытов, когда приходится тщательно оберегать животных от возможных посторонних инфекций, которые могут обесценить в дальнейшем результаты опытов. Для установления патогенности определенного вируса немаловажное значение, помимо выбора подходящего животного, имеет и способ введения в организм нужной дозы вируса. Последний вводится обычно при помощи инъекционного шприца, чаще всего под кожу, иногда в мозг, брюшную полость…

Действительно, уже с 1931 года ученым чрезвычайно помогло применение развивающегося куриного зародыша как при разработке диагностики вирусных заболеваний, так и при совершенствовании методов предупреждения многих инфекций. Схема куриного эмбриона вместе с различными его оболочками в оплодотворенном курином яйце на 11-й день его развития. Зародыш как бы плавает вамниотической полости, которую образует мешок- из очень тонкой мембраны, наполненный жидкостью, защищающей эмбрион от толчков и ударов. Питание эмбриона обеспечивается хорионаллантоисной оболочкой, выстилающей полость яйца, которая заполнена аллантоисной жидкостью, где скапливаются отходы обмена веществ зародыша. Много лет развивалась техника инъекций, при помощи которых вирусологи вводили вирусный материал в те или иные полости, желточный…

Куриный эмбрион хорошо защищен от внешних воздействий яичной скорлупой, препятствующей проникновению других вирусов и развитию побочной инфекции, что может нарушить эффективность опыта и привести к ошибочным данным. Если яйца поступают из контролируемых инкубаторов, возможность скрытой инфекции минимальна — в отличие от осложнений, связанных со скрытой инфекцией у мышей или других млекопитающих. Другой выгодной стороной работы с куриным эмбрио-йом является то, что здесь не нужны ни клетки, ни дорогостоящее содержание и уход. Достаточно иметь инкубатор, представляющий деревянный шкаф с постоянно поддерживаемыми температурой и влажностью, где на особых полках размещаются сотни яиц.

Куриный эмбрион, инфицированный вирусным материалом, ставят в инкубатор на 2—3 дня, в зависимости от характера внесенного вируса. Для развития вирусов из проб, взятых у больного (например, смывов из носоглотки, использующихся при диагностировании гриппа), куриный эмбрион представляет хорошую среду. По типу изменений, скажем в тканях хорионаллантоисной оболочки, можно непосредственно определить, с каким вирусом мы имеем дело. Очень характерные изменения дают вирусы оспы и герпеса. Некоторые вирусы очень интенсивно размножаются в различных тканях куриного эмбриона и дают исходный материал для приготовления вирусных антигенов, необходимых при лабораторной диагностике вирусных заболеваний. Вирусы, размноженные в курином эмбрионе, были использованы как исходный материал для получения восемнадцати…

Понадобилось полвека, чтобы, наконец, этот метод культивирования клеток на искусственной среде стал широко применяться во всех лабораториях мира. В 50-х годах американские ученые Дж. Эндерс, Т. Уэллер и Ф. Роббинс описали относительно простой способ выращивания кусочков ткани человеческого зародыша (нескольких недель развития). Исследователи показали в своей работе, что культура ткани, жизнь которой поддерживалась вне материнского организма, восприимчива к вирусу полиомиелита. Вирус хорошо размножался в культивируемых клетках, постепенно приводя их к гибели, что можно было легко наблюдать в обычном микроскопе. Эта работа положила основу широкому внедрению метода культуры клеток, который вскоре был освоен почти всеми вирусологическими лабораториями мира. Так начался новый…

Культуру этих тканей готовят следующим образом. Из организма в стерильных условиях вычленяют определенные органы или кусочки ткани. Амниотическую пленку получают непосредственно после родов. Из исходных материалов особым методом приготавливают необходимое число первичных культур. Для этого свежий, только что изъятый из организма орган или кусок ткани разрезается на мелкие кусочки и обрабатывается раствором трипсина (пищеварительного фермента, расщепляющего белки). Под его действием клетки освобождаются от соединительной ткани, ненужной для поставленной цели. Потом клетки промывают и некоторое время отстаивают, чтобы очистить от остатков трипсина. Разреженную массу клеток переносят (в определенном количестве) на питательную среду, в культуральные сосуды или стеклянные пробирки, которые закупоривают резиновыми…

Клетки под влиянием силы тяжести оседают на дно или задерживаются на стенках сосуда, начинают там размножаться и по прошествии двух-трех дней сплошным слоем устилают дно, а иногда и стенки, постоянно омываемые питательным раствором. Последний состоит обычно из особой смеси аминокислот, обогащенной добавленными белками, и близок по составу к коровьей или человеческой сыворотке. Питательный раствор периодически сменяют в зависимости от типа выращиваемых клеток. При таком режиме культуры живут сравнительно долгое время, иногда до нескольких недель. Клеточные культуры, полученные непосредственно из органов и выращиваемые в первый раз в стеклянной посуде, называются первичными. Помимо первичных клеточных культур в вирусологии часто применяются клетки перевиваемых…

Чистая, простая, но очень тонкая и точная работа с культурами клеток во многих случаях заменила использование подопытных животных или куриных эмбрионов. Эти линии состоят из одного слоя одинаковых клеток, обычно продолговатой формы, удобной для наблюдения и контроля в оптическом лабораторном микроскопе. Существуют линии, которые используются во всем мире. Годами выращивают их в одних и тех же условиях, что обеспечивает, помимо прочих преимуществ, еще и стандартность работы с ними и сравнимость результатов, полученных в разных учреждениях. Примером может быть известная перевиваема линия клеток HeLa, выращенных из опухолевой ткани больной раком матки, по инициалам которой (Н и L) клетки и были названы.…

Упомянем еще один вид использования культуры клеток, положивший начало генетическому изучению вирусов. Этот метод позволил получать «чистые» популяции вируса, характеризующиеся одинаковыми генетическими свойствами (в рамках естественной изменчивости). А получить чистую популяцию вируса — это значит располагать потомством одной-единственной вирусной частицы. Каким же путем этого можно достичь? На плоском дне чашки Петри выращивается однослойная культура клеток, восприимчивых к данному вирусу. Слой этот инфицируется вирусной суспензией в такой концентрации, чтобы в культуру попали от 20 до 30 инфекционных доз вируса. Затем зараженные клетки заливают теплой питательной средой с агаром, которая после охлаждения застывает. Культура закладывается в термостат и стоит там при температуре…

В нашей книге нет ни места, ни возможности перечислить и объяснить все биологические, биохимические, биофизические и молекулярно-биологические методы, применяемые сегодня при решении задач медицинской вирусологии. Мы упомянем лишь основные, наиболее важные методы, и то в самых общих чертах, не сопровождая их точными определениями и подробными описаниями. В первую очередь познакомимся с методами, позволяющими установить количество инфекционных вирусных частиц или инфекционных единиц в анализируемом материале. Вот для этого и проводится титрование вируса. При этом исходят из предположения, что в опыте с животными или культурами клеток достаточно очень малого числа, а иногда и единственной частицы вируса, чтобы вызвать инфекцию (естественно, при соответствующих…